本報(bào)訊 近日，我校生命學(xué)院黃志偉教授課題組通過研究揭示Anti-CRISPR蛋白抑制SpyCas9活性的分子機(jī)制，為設(shè)計(jì)時(shí)間、空間特異性地，條件性地精確控制SpyCas9基因編輯活性的工具提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。4月27日，該項(xiàng)研究成果以研究論文形式在《自然》（《Nature》）在線發(fā)表，題目為 《Anti-CRISPR蛋白抑制CRISPR-SpyCas9活性的分子機(jī)制》（StructuralbasisofCRISPR-SpyCas9inhibitionbyananti-CRISPRprotein）。
　　CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌編碼的用來保護(hù)細(xì)菌免受噬菌體感染的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過crRNA引導(dǎo)的Cas核酸酶剪切入侵病毒的DNA或者RNA從而防御病毒感染。由于CRISPR-Cas系統(tǒng)與sgRNA組合具備高效、便捷“編輯”目的DNA的能力，CRISPRII-A亞型系統(tǒng)之一的鏈球菌Cas9（SpyCas9）系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于全世界范圍內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)研究以及基因治療領(lǐng)域，進(jìn)行細(xì)胞、組織或個(gè)體內(nèi)DNA的敲除、激活、修飾、突變等，而且該系統(tǒng)已經(jīng)成為目前最重要的、也是最廣泛使用的基因編輯工具。
　　但是，如何減少SpyCas9過度激活或者長時(shí)間活性帶來的基因編輯脫靶效應(yīng)，以及如何對SpyCas9的活性進(jìn)行時(shí)間、空間或條件性的精確控制，是當(dāng)下SpyCas9系統(tǒng)用于細(xì)胞或組織基因編輯、基因治療等亟須解決的重要并具挑戰(zhàn)性的科學(xué)問題。早先的研究發(fā)現(xiàn)一類來自于 Listeriamonocytogenes前噬菌體的 Anti-CRISPR基因 AcrIIA4等在細(xì)胞內(nèi)能夠抑制SpyCas9的基因編輯活性，然而這些 Anti-CRISPR基因抑制SpyCas9活性的分子機(jī)制并不清楚。
　　為了研究AcrIIA2或AcrIIA4是否能夠直接結(jié)合SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學(xué)研究系統(tǒng)，研究發(fā)現(xiàn) Anti-CRISPR蛋白AcrIIA2或 AcrIIA4直接結(jié)合 SpyCas9-sgRNA復(fù)合物，有趣的是AcrIIA2或AcrIIA4只和結(jié)合有sgRNA的SpyCas9有相互作用，而和單獨(dú)SpyCas9并沒有相互作用；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AcrIIA2或AcrIIA4能夠直接抑制SpyCas9介導(dǎo)的目的DNA的剪切。
　　為了研究AcrIIA4直接抑制SpyCas9活性的分子機(jī)制，課題組純化出SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4復(fù)合物，并通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究方法解析了SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，該復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示AcrIIA4蛋白構(gòu)像是一個(gè)新的折疊，它結(jié)合在 SpyCas9的 CTD、TOPO和RuvC三個(gè)結(jié)構(gòu)域形成的凹槽區(qū)域。該凹槽區(qū)域正是SpyCas9上的底物PAM DNA的結(jié)合位點(diǎn)；另外來自AcrIIA4的β1折疊片前的Loop與RuvC活性位點(diǎn)接觸也加強(qiáng)了AcrI鄄IA4對SpyCas9的抑制作用。上述結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果顯示AcrIIA4和底物PAM DNA競爭性結(jié)合SpyCas9，AcrIIA4比底物PAM DNA具有更強(qiáng)的親和力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步支持了結(jié)構(gòu)觀察的結(jié)果。接下來的生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AcrIIA4結(jié)合SpyCas9后抑制底物PAM DNA結(jié)合SpyCas9，從而拮抗SpyCas9的活性。
　　非常顯著的是，AcrIIA4的酸性氨基酸Asp14、Asp37、Glu40、Asp69和 Glu70的位置完全與結(jié)合SpyCas9的底物PAM DNA的磷酸主鏈位置一致，而且上述AcrIIA4的氨基酸直接和SpyCas9PI結(jié)構(gòu)域上的PAM DNA識(shí)別氨 基 酸 Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335和Arg1333互作。這些結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果揭示AcrIIA4通過模擬PAM DNA結(jié)合SpyCas9。SpyCas9蛋白的AcrIIA4結(jié)合氨基酸在同亞型N.meningitidisCas9(NmeCas9)中保守，而在不同亞型 II-C ListeriamonocytogenesCas9(LmoCas9)中并不保守，從而很好地解釋了AcrIIA4為什么能抑制LmoCas9的活性，卻不能抑制NmeCas9的活性。
　　課題組通過進(jìn)一步結(jié)構(gòu)比較、分析發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)SpyCas9上并不存在AcrIIA4的結(jié)合位點(diǎn)，SpyCas9-sgRNA復(fù)合物的形成，使得SpyCas9構(gòu)象發(fā)生顯著變化，組裝形成AcrIIA4結(jié)合位點(diǎn)，從而很好地解釋了本項(xiàng)目初始生化研究結(jié)果顯示的AcrIIA4只結(jié)合SpyCas9-sgRNA復(fù)合物，而不結(jié)合單獨(dú)SpyCas9。該結(jié)果也和細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)SpyCas9是瞬時(shí)存在的，而SpyCas9-sgRNA復(fù)合物是主要存在形式相一致。Spy鄄Cas9-sgRNA復(fù)合物形成時(shí)，也是噬菌體被細(xì)菌CRISPR免疫系統(tǒng)“發(fā)現(xiàn)”并將被“干擾”之時(shí)，因此，這個(gè)階段（SpyCas9-sgRNA復(fù)合物期）是噬菌體抑制細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（CRISPR-Cas9）的最合適時(shí)期。
　　該研究揭示的Anti-CRISPR 蛋白AcrI鄄IA4抑制SpyCas9活性的分子機(jī)制，不僅對揭示細(xì)菌免疫系統(tǒng)（CRISPR-Cas9）與噬菌體防御系統(tǒng)（Anti-CRISPR）“軍備競賽”的共進(jìn)化分子機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，而且為設(shè)計(jì)時(shí)間、空間特異性地，或條件性地精確控制SpyCas9基因編輯活性的工具提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。該成果是黃志偉團(tuán)隊(duì)繼CRISPR-Cpf1（Nature，2016；RNABiology，2017）、CRISPR-C2c1(CellRe鄄search，2017)等研究成果之后，在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機(jī)制研究領(lǐng)域取得的又一重要研究成果。
　　黃志偉教授為本研究論文的通訊作者，該團(tuán)隊(duì)的博士研究生董德、郭明慧和碩士研究生王思涵3位同學(xué)為該論文的并列第一作者。該團(tuán)隊(duì)的師資博士后朱玉威、碩士生王碩、熊智、楊建增、本科生徐增亮參與部分研究工作。全部研究工作在哈工大完成。上海同步輻射中心為晶體數(shù)據(jù)收集提供了支持。本項(xiàng)目受到國家自然科學(xué)基金委、哈工大青年科學(xué)家工作室等基金的資助。 （王計(jì)）